快速心房起搏对兔心房重构及NPR/pGC/cGMP信号通路的影响

【摘要】心房颤动(房颤)是临床上常见的心律失常之一,严重影响人类健康和生活质量,但是其确切的发病机理尚不清楚。房颤时以心房结构重构、电生理重构以及钙离子分布异常可导致心房产生多重折返波,进而促进房颤的维持。环磷酸鸟苷作为心脏功能调节的胞内第二信使,其细胞内的水平通过鸟苷酸环化酶激活而生成的过程和被PDE分解的两个过程来达到动态平衡以维持细胞内适当浓度。临床研究表明,房颤时血中ANP和BNP浓度增高,而且与心房颤动病程相关,但是房颤心房重构和NPR/pGC/cGMP在房颤心房组织中的变化及其病理生理学效应尚不清楚。因此,本文对快速起搏心房结构变化、离子通道变化及NPR/pGC/cGMP信号通路进行了研究,为进一步阐明房颤心房重构的机制提供新的靶点[方法]建立家兔快速心房起搏模型,利用RM6240生理信号采集系统,同时刺激和记录体表肢体导联心电图；利用光镜和透射电镜观察心房肌结构变化,发现并证实快速起搏对心房肌肌浆网和线粒体等超微结构的影响；在此基础上,利用RT-PCR、免疫印迹和分光光度法检测P0和P8对L型Ca2+通道、GRP78、JNK和CHOP的表达和活性变化以及线粒体mPTP开放程度,从分子水平上对比研究结构重构与电重构的关系；利用放射免疫分析技术分别检测P0(对照组)、P1、P2、P4及P8血清ANP水平；利用免疫组化和免疫印迹法检测心房组织钠尿肽受体的表达；同时利用ELESA法测定心房组织cGMP浓度和间接观察快速起搏心房对pGC活性的影响；探讨快速心房起搏引起cGMP浓度变化的机制及其对心房重构之间的关系。[结果]1.利用右侧颈外静脉穿刺法植入电极,体外心电图检测电生理变化和电极定位右心房建立家兔快速心房起搏模型,稳定可靠,更容易模拟心房颤动发生。2.利用光镜和透射电镜观察快速心房起搏不同时刻心房组织结构变化,结果：①HE染色可见,心房肌纤维呈长带状、有分支,其分支连接成网状。核呈卵圆形,位于肌纤维中央,心房肌纤维可见明暗相间的横纹,且对照组(P0)和起搏不同时刻(P1、P2、P4、P8)组之间无明显的改变。②透射电镜观察(P0、P1、P2、P4、P8)超微结构,可见肌浆网扩张,线粒体肿胀、变形、嵴排列紊乱、消失,大量空泡形成和糖原颗粒聚集明显,肌丝溶解,核膜断裂、凹陷,随着刺激时间损伤加重,P8更加明显。因此本研究选取P0和P8心房组织进行了深入研究。3.利用RT-PCR、Westernblot方法和分光光度计检测P0和P8心房组织L型Ca2+通道、GRP78、CHOP和JNK的表达和活性变化以及线粒体mPTP开放程度,结果可观察到,①L-型钙通道亚单位α1的mRNA表达在快速起搏P8无明显的变化；②P8心房组织GRP78和CHOP表达与PO相比明显增加；③P8心房组织磷酸化JNK表达与P0相比明显增高；④分光光度计结合肿胀缓冲液诱导法测定P0和P8心房组织mPTP开放程度,在200umol/LCa2+的诱导下,P8心房肌线粒体吸光度迅速下降,P0和P8分别是0.027±0.009和0.109±0.021(P<0.01),提示P8心房肌线粒体mPTP开放与P0相比明显增高。4.放射免疫分析技术测定P0、P1、P2、P4及P8家兔血中ANP浓度,结果分别为1.877+0.112、2.476±0.189、2.397±0.147、2.356±0.137和2.141±0.157μg/L(P<0.01)；起搏1h组家兔血浆中ANP浓度最高,随着起搏时间ANP浓度逐渐下降,但是均高于P0。5.ELISA法测定P0、P1、P2、P4及P8心房组织cGMP浓度,结果P1心房组织cGMP浓度高于P0,但是随着刺激时间逐渐下降,P8心房组织cGMP水平低于P0,有统计学意义(P<0.01)。6.免疫组化、免疫印迹结合酶联免疫法测定心房组织钠尿肽受体A和B的表达以及鸟苷酸环化酶的活性变化,结果①P0和P8心房组织均表达NPR-A和B受体,可观察到散在分布的棕色颗粒,但是其表达无明显差异；②Westernblot对NPR-A/B进行进一步定量结果也显示,P0和P8之间无统计学差异；③ELISA结合分离膜碎片法间接测定pGC活性,发现P8心房组织pGC活性明显低于P0。[结论]1.家兔快速心房起搏可模拟房颤发生早期心房重构,结果稳定、可靠。2.快速心房起搏早期肌浆网和线粒体结构改变早于离子通道密度的改变。3.快速起搏可导致线粒体膜电位的改变和内质网应激,进而引起心房重构过程中心肌细胞内钙分布异常。4.ANP通过NPR-A/pGC-cGMP途径参与房颤心房重构。5.快速心房起搏早期心房肌因pGC活性减弱导致cGMP浓度降低。6.快速心房起搏早期cGMP浓度下降是心房重构的重要机制之一。7.干预NPR/pGC/cGMP信号通路环节,可能是防治房颤致心房重构的药理学靶点。
【作者】玄春花；
【导师】关立克；
【作者基本信息】延边大学，内科学，2014，博士
【关键词】心房颤动；心房结构重构；心房电重构；线粒体；肌浆网；ANP；NPR；膜结合型鸟苷酸环化酶；cGMP；

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